近日，《Marine Life Science & Technology》杂志在线发表了上海交通大学科研团队研究成果“Towards enriching and isolation of uncultivated archaea from marine sediments using a refined combination of conventional microbial cultivation methods”，上海交通大学生命科学技术学院博士生胡海宁和Vengadesh Perumal Natarajan博士为共同第一作者，生命科学技术学院王风平教授为通讯作者。

    在实验室条件下易生长的古菌类群仅仅占自然界中所有古菌多样性的的一小部分。如今，分子生态学方法，例如宏基因组测序，能够在无需细胞培养的情况下提供古菌的有用信息。然而，想要充分表征他们的生理特征和生态特征，依然必须通过培养试验。相较于发展日益成熟的分子技术，古菌的培养被证明更具挑战性，尤其是来自寡营养厌氧环境（例如深海沉积物）的古菌类群，通常有着较长的传代时间。传统的纯菌分离方法，例如减绝稀释和平板划线，经常用于分离生长快速的微生物，但不适用于生长缓慢的微生物。此外，周围环境的剧烈转变，如从原位的寡营养到培养基的富营养，会降低细胞的存活率或诱导细胞进入休眠状态，最终导致培养失败。因此，在尝试分离纯菌之前，先建立能够在富营养的实验室条件下稳定传代的富集培养物是必要的。

    本研究利用一系列传统微生物培养方法从海洋沉积物中富集和分离未培养古菌。通过排列和组合这些方法，作者建立了一套完整的从海洋沉积物中富集和分离未培养古菌的方法体系，并通过该体系从南海沉积物中分离出三种仅包含深古菌（亚群8）和一种细菌（假单胞属或谷氨酸杆菌属）的共培养物。

    方法依次包括细胞提取，大小分级，富集培养以及一种改良的滚瓶技术。首先，细胞从南海沉积物样品中被提取出来。细胞提取浓缩细胞的同时排除原位环境中成分不明的化合物和颗粒。提取出的细胞依次通过0.8 μm, 0.6 μm和0.2 μm的滤膜，被分割成不同尺寸范围的组分。细胞的大小分级有效降低古菌多样性，同时富集特定的古菌类群在不同的组分中（图1A）。然后，针对每个组分的古菌组成，添加各类基质（比如甲烷，硫酸盐，和木质素等），接着进行漫长的厌氧传代培养，目的在于建立不同的营养条件下稳定传代的富集培养物。结果显示不同的营养条件导致了不同古菌类群的富集。其中，深古菌（亚群8）被多种有机质显著地富集（图1B-D）。深古菌是南海沉积物分布的主要古菌类群之一，且被认为是一种异养菌。前人报道过木质素促进深古菌亚群8的生长，并基于代谢试验和基因组信息等多方面证据推测深古菌亚群8能够以自养的方式同化二氧化碳，同时利用木质素作为一种能源。本研究中，木质素同样对深古菌亚群8有促生长作用，但需指出的是此处使用的沉积物样品来自深海，且培养温度是10 ℃。因此，在此富集的深古菌亚群8细胞是一类适应低温度的类群。而前人的报道则不同，他们富集的深古菌亚群8来自海岸环境，且培养温度是30 ℃。无论如何，利用木质素的能力似乎是深古菌亚群8的普遍特征。当然，需要进一步的研究来理解木质素在深古菌亚群8生长过程中扮演的角色，同时阐明深古菌亚群8代谢木质素的机制。

图1 基于16S rRNA基因分析的古菌组成。沉积物样品，从沉积物样品提取的细胞，和经大小分级后的不同组分 (A)；添加各类基质经四个月的富集培养后的>0.8 μm组分 (B)，0.6-0.8 μm组分 (C)和0.2-0.6 μm组分 (D)

    获取高细胞活性的富集物后，本研究主要利用一种滚瓶技术分离纯菌（图2）。该技术是作者根据Hungate的经典厌氧培养方法改良而来，能够实现传统的纯菌分离方法，如平板涂布/划线，在一个密封的滚瓶里完成，从而提供稳定的生长环境，严格的厌氧条件和较低的污染风险。该技术帮助作者从木质素培养基和硫酸盐/甲烷培养基的滚瓶中共分离出三种仅包含深古菌（亚群8）和一种细菌（假单胞属或谷氨酸杆菌属）的共培养物（图2C）。显然，这三种共培养物能利用木质素或硫酸盐/甲烷生长。然而，共培养物中的深古菌是否与细菌有互利共生的联系仍不清楚，有待于进一步研究。

图2 滚瓶技术的原理图和照片。(A) 滚瓶的制备原理；(B) 冰上的滚瓶；(C) 制备好的滚瓶，内含木质素培养基（左图），和硫酸盐/甲烷培养基（右图）；(D) 10×或者20×放大镜

    本研究的结果证明，将细胞提取，大小分级，富集培养和滚瓶技术以合理的方式组合而成的方法体系能帮助研究者成功从海洋沉积物中富集和分离生长缓慢的古菌类群。

    该研究得到了国家重点研发计划（2016YFA0601102）和中国大洋矿产资源研究开发协会（DY135-B2-12）等项目的资助。

论文链接：https://doi.org/10.1007/s42995-021-00092-0